上一期中我们介绍了Orbitrap Eclipse™三合一质谱仪极其出色的硬件性能，以及在蛋白质组学领域的非凡表现。本期带大家领略其如何将生物制品质谱表征工作变得更简单、看到生物制品最真实的原貌！
当前常规生物制品质谱表征主要包含完整分子量的测定、肽图解析、糖型鉴定等，通常利用不同的样品前处理获得复杂生物制品的完整分子量、氨基酸序列结果，然而在一定程度上却失去了样品的完整信息，引入其他副反应。大家知晓可以用Top-Down、Middle-Down的分析流程解决这一问题，但由于质谱仪性能的局限，未得到广泛的应用。
赛默飞作为科研领域的先者，致力于解决分析难题，全能型Orbitrap Eclipse™将“简单又复杂”的生物制品质谱表征带入了“Top/Middle-Down时代”。
1复杂生物制品的完整分子量测定——糖基化位点较多的融合蛋白类
得益于PTCR（质子转移电荷减少）技术、深度真空技术（气压可调0.5-20mTorr）。
单克隆抗体及ADC类蛋白样品异质性相对较低，在传统的LC-MS/MS（变性反相色谱或非变性分子排组色谱条件）中能够获得高信噪比、高质量精度的各成分及其含量分布。而含N-糖或O-糖位点较多的融合蛋白类，如细胞因子融合蛋白，异质性非常高，即使在非变性去唾液酸条件下仍旧无法有效区分每一成分（图1A），通常的解决方式是使用各种糖苷酶去除不同种类糖型，降低谱图复杂性，然而却失去了样品的完整水平糖型信息。
图1. 细胞因子融合蛋白分子量测定; 1A. 去唾液酸后在native条件质谱图 1B.经过PTCR反应后质谱图 1C.经BioPharma软件去卷积后的各成分质量(Data Courtesy: Wendy Sandoval, Genentech)
Orbitrap Eclipse™ 针对不同的样品分析可调节IRM中气压，提高信号响应，以及PTCR强力的加持技术则可简单快速的解决此类困扰已久的难题，如图1所示，在图1A中选择带多质子且信号强度较高的m/z5677-5757范围，经PTCR反应后降低质子数，从而降低各电荷态间的重叠度（图1B），此时可清晰的分辨每一成分，BioPharma Finder软件去卷积后获得该融合蛋白主要成分的分子量（图1C），为复杂生物制品的表征提供完整信息。
2非变性蛋白Top-Down分析
得益于ETD、EThcD、UVPD、HCD、深度真空技术、HMRⁿ、PTCR技术
（全能型Orbitrap Eclipse™三合一质谱仪集各种利器于一身）
对于做蛋白药物质谱表征分析的人来说，理想的状态是使用快速简单甚至无需样品前处理，直接进入LC-MS/MS或MS only对蛋白药物进行表征，高效且降低样品前处理引入的干扰，同时可直接对电荷变异体成分进行快速的确证。而现实是由于抗体分子大，碎片离子少且复杂导致在完整蛋白水平获得较低的序列覆盖度，实用价值低。Orbitrap Eclipse™将非变性完整蛋白Top-Down分析推向崭新的高度。
以Herceptin®抗体为例，溶液置换成50mM乙酸铵（Herceptin®浓度为2ug/uL），不经LC通过注射泵直接进入MS中，获得高信噪比高质量精度的一级谱图（图2），隔离丰度的母离子（+27价）分别进行HCD、ETD、EThcD及UVPD的碎裂，且使用Orbitrap 240,000分辨率进行高准确度二级碎片离子扫描，由于Orbitrap Eclipse™具有HMRⁿ选项，可在二级谱图中看到m/z达8000的丰富碎片离子。
图2.非变性Herceptin®高质量精度的一级质谱图，不同碎裂模式下的二级质谱图
图3. 经BioPharma Finder解析后轻重链氨基酸序列覆盖度
经BioPharma Finder解析后，轻链氨基酸序列覆盖度为57%，重链氨基酸序列覆盖度为36%（图3），碎片离子质量偏差在3ppm以内，Orbitrap Eclipse™在非变性条件下Top-Down结果刷新了以往的记录⁽¹⁾。
值得注意的是，PTCR技术不仅在复杂生物制品分子量测定中大显身手，而且能够显著降低ETD MS²谱图的复杂度（图4），大大提高质量碎片离子的解析度（图5），从而提升Middle-Down氨基酸序列的覆盖度（图6）。
图4.NIST mAb Fd亚基经ETD碎裂以及PTCR反应后的二级碎片离子质谱图
图5.ETD only与ETD with PTCR二级/三级碎片离子鉴定分布图
图6.NIST标准抗体Middle-Down氨基酸序列覆盖度
3基于以上独特的优势性能，可进一步扩展其应用领域
如电荷变异体的快速鉴定；利用MHC(Major Histocompatibility Complex)-peptide复合物筛选高免疫原性疫苗时，采用Orbitrap Eclipse™测定复合物的完整分子量和Top-Down，来评估多肽的交换（图7）；此外多种碎裂方式与超高分辨率Orbitrap的组合能够更加准确的对未知蛋白进行从头测序（De-novo sequencing）。
图7.Orbitrap Eclipse™评估MHC与多肽的交换，助力高免疫原性疫苗的筛选（Data Courtesy :Genentech）
结语：目前Orbitrap Eclipse™是功能最为齐全的高分辨质谱仪之一，旨在解决蛋白质分析中极具挑战的问题，持此利器定能推动生物学研究的进一步发展。
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